عدوى Ascosphaera apis (مرض الحضنة الطباشيرية) تغير تكوين بكتيريا الأمعاء في نحل العسل
بواسطة الكلمات الرئيسية: نحل العسل؛ نوزيما سيرانا أبيس ميليفيرا نوزيموسيس. الحضنة الطباشيرية. Ascosphaera apis 1
المقدمة تنتج مستعمرات النحل غالبية 57 محصولًا أساسيًا للاستهلاك البشري ، مما يجعلها أكثر الملقحات التي تتم إدارتها في العالم [1،2،3]. يشكل تدهور نحل العسل تهديدًا خطيرًا لإنتاجية واستقرار الزراعة العالمية. تعد الطفيليات بالفعل أحد العوامل المسببة لهذه الانخفاضات. يمكن أن تختلف تركيبة بكتيريا أمعاء نحل العسل ، اعتمادًا على عوامل مختلفة مثل الجغرافيا ، والنظام الغذائي ، والموسم ، وممارسات الإدارة [4]. ومع ذلك ، فإن بعض الأنواع البكتيرية الشائعة الموجودة في أمعاء نحل العسل تشمل Lactobacillus و Bifidobacterium و Gilliamella. تلعب هذه البكتيريا أدوارًا مهمة في هضم العناصر الغذائية وامتصاصها ، وتنظيم جهاز المناعة ، والحماية من مسببات الأمراض [5]. اشتدت أزمات الأمراض في نحل العسل في السنوات الأخيرة ، ويتم إيلاء اهتمام متزايد لمعالجة هذه القضية. على مدى السنوات العديدة الماضية ، كانت هناك خسائر سنوية تتراوح بين 30٪ و 40٪ من جميع مستعمرات نحل العسل الأمريكية المُدارة [6،7،8]. بالإضافة إلى الفيروسات والبكتيريا والميكروسبوريديا والمفصليات ، فإن مجموعة متنوعة من الطفيليات تشكل مخاطر جسيمة على نحل العسل [1،9،10].
الأمراض الفيروسية التي تسبب مشاكل للنحل تشمل فيروس نحل كشمير ، فيروس شلل النحل الحاد (ABPV) ، فيروس الجناح المشوه (DWV) ، فيروس خلية الملكة السوداء (BQCV) ، فيروس شلل النحل الحاد (ABPV) ، فيروس الجناح المشوه (DWV). ) [11]. دمار الفاروا هو عث طفيلي يشكل تهديدًا كبيرًا لتعداد نحل العسل في جميع أنحاء العالم [12]. تتغذى هذه العث على الدملمف (سائل الدورة الدموية) لكل من نحل العسل البالغ والحضنات النامية ، مما يسبب ضررًا جسديًا ويضعف النحل [13]. لا تؤدي الإصابة بالعث إلى تدهور صحة النحل الفردية فحسب ، بل يمكنها أيضًا تسهيل انتقال فيروسات نحل العسل المختلفة ، مما يؤدي إلى تفاقم انهيار الطائفة [14]. تم الإبلاغ عن مرض الحضنة الأمريكية (AFB) و الحضنة الأوروبية (EFB) كأمراض بكتيرية ، و Nosema كمرض أولي ، و Chalkbrood و Stonebrood كأمراض فطرية [15،16،17]. من بين هذه الأمراض ، يعد مرض Nosemosis و Chalkbrood من أخطر الأمراض في جمهورية كوريا [18].
يعتمد نحل العسل على مجتمع متنوع من الميكروبات للمساعدة في الهضم والتغذية والحماية من مسببات الأمراض. تتكون الأمعاء المطورة لأمعاء نحل العسل العاملة من أربعة متعايشات بكتيرية أساسية توجد بشكل أساسي في المعى الخلفي: Snodgrassella alvi و Gilliamella apicola و Lactobacillus و Bifidobacterium asteroides [5،19]. يتم الحصول على هذه المكونات داخل مستعمرة المنزل ويتم إنشاؤها بشكل أساسي بعد 9 أيام من خروج النحلة من الخلية [20،21]. تنتشر بكتيريا الأمعاء الأخرى بشكل متكرر ، ولكن انتشارها أقل نسبيًا وبتماسك أقل عبر النحل والمستعمرات. تحدث العديد من عمليات التمثيل الغذائي في المعى الخلفي ، خاصة في سياق تكافلي. من المتعايشات البكتيرية الأساسية ، G. apicola و Bifidobacterium و Lactobacillus هي مخمرات كربوهيدراتية تدعم منتجاتها الأيضية نمو S. alvi [22،23]. من المحتمل أيضًا أن تدعم هذه المستقلبات المشتقة من التعايش صحة النحل عن طريق الامتصاص المعوي. تم دعم هذه النتائج من خلال دراسات التغذية الميكروبية التي تركز على العمليات الفسيولوجية للنحل ، وشروح الميتاجينوم للمتعايشين [4،24]. يقع المعى المتوسط في أعلى مجرى المعى الخلفي. المعي المتوسط لنحل العسل هو النقطة المحورية لهضم وامتصاص العناصر الغذائية. يحتوي على إنزيمات هضمية من بطانة الخلية ، بالإضافة إلى الإنزيمات التي يتم إفرازها ونقلها من الغدد البلعومية [25 ، 26]. كما أن المعى المتوسط مبطن بمصفوفة بيريتروفيك ، وهي عبارة عن حاجز وقائي. بالنسبة إلى المعى الخلفي ، فإن المعى المتوسط خالي من البكتيريا ، ربما بسبب إعادة الترتيب المستمر للمصفوفة المحيطة [20]. يُعتقد أن المعى المتوسط للنحل يأوي الخمائر التي تقدم أدوارًا إضافية في الجهاز الهضمي ، كما هو شائع في الحشرات الأخرى [27]. يشير هذا إلى أنه من المحتمل أن يكون للخمائر طريقة بديلة للارتباط / الاستعمار في هذه البيئة التي تفتقر إليها البكتيريا [22].
منذ اكتشافه في عام 1909 ، يُنظر إلى Nosemosis على أنه مرض موسمي له تأثير سلبي على أرباح تربية النحل. يصيب طفيلي ميكروسبوريدي يسمى نوزيما سيرانا نحل العسل ويمكن أن يضر بشكل خطير مستعمرات نحل العسل [28،29]. أظهرت الأبحاث أن عدوى نوزيما سيرانا يمكن أن تغير تكوين بكتيريا أمعاء نحل العسل ، مما يتسبب في وفرة وتناقص البكتيريا المفيدة مثل العصيات اللبنية وزيادة البكتيريا الضارة المحتملة مثل المكورات المعوية [30،31]. في الربيع ، يشعر الكثيرون بالإرهاق وبسبب تأثيرات Nosemosis ، يتم اكتشاف نحل ميت في جميع أنحاء خلايا النحل [32].
أكثر مسببات الأمراض حقيقية النواة انتشارًا في نحل العسل هي نوزيما سيرانا. على الرغم من أن العدوى عادة ما تكون مزمنة ، إلا أنها قد تكون قاتلة أيضًا. ربطت الأبحاث الحديثة بين تطور أمراض الأمعاء المعدية وميكروبات الأمعاء [21،33]. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات وجدت ارتباطات إيجابية وليست سلبية بين عدوى نوزيما سيرانا والبكتيريا الرئيسية في ميكروبات نحل العسل [34]. تعتبر ميكروبيوتا الأمعاء في نحل العسل أساسية وتتكون بشكل أساسي من عدد قليل من الأنواع البكتيرية الرئيسية. لا يوجد الكثير من بكتيريا الأمعاء في الأمعاء الوسطى ، ربما بسبب التجدد المستمر للغشاء الصفاق [35،36،37].
أحد مسببات الأمراض الفطرية Ascosphaera apis يصيب يرقات نحل العسل ، مسبباً مرضاً يعرف باسم الحضنة الطباشيرية [38]. بينما أظهرت الأبحاث أن الحضنة الطباشيرية يمكن أن يكون لها تأثيرات كبيرة على صحة نحل العسل ، هناك معلومات أقل عن التأثيرات المحددة لـ Ascosphaera apis على تغيير تكوين بكتيريا الأمعاء في نحل العسل [39،40]. على العكس من ذلك ، فقد بحثت بعض الدراسات في تأثير مرض الحضنة الطباشيرية (الناجم عن كل من Ascosphaera apis و Ascosphaera larvis) على ميكروبيوم الأمعاء ليرقات نحل العسل. على سبيل المثال ، قللت اليرقات المصابة بدم الطباشير من مستويات بعض الأنواع البكتيرية المفيدة ، مثل Lactobacillus و Bifidobacterium ، في أمعائها مقارنة باليرقات السليمة [40،41،42]. وجدت الدراسة أيضًا زيادة في وفرة البكتيريا التي يحتمل أن تكون ضارة مثل Enterobacter و Pseudomonas في اليرقات المصابة بدمأة الطباشير [43]. المواد الصلبة هي بكتيريا موجبة الجرام وتشمل مجموعة متنوعة من البكتيريا ، والتي يوجد بعضها بشكل شائع في أمعاء نحل العسل [44]. من المعروف أنها تلعب أدوارًا مهمة في هضم العناصر الغذائية وتنظيم جهاز المناعة والحماية من مسببات الأمراض. بعض عائلات الثبات الشائعة الموجودة في أمعاء نحل العسل تشمل العصيات اللبنية ، العصوية ، والمكورات العقدية [44 ، 45 ، 46]. أشارت الدراسات إلى أن الوفرة النسبية المرتفعة من المواد القوية ترتبط بصحة أفضل لنحل العسل ومقاومة أكبر للأمراض مثل مرض الحضنة الأمريكية ، في حين أن الوفرة النسبية العالية من البكتيريا المتقلبة ترتبط بزيادة القابلية للإصابة بأمراض معينة [5،47]. اقترحت العديد من الدراسات أن Lactobacillus قد تلعب دورًا وقائيًا ضد عدوى Nosema و Chalkbrood في نحل العسل [48 ، 49]. على سبيل المثال ، دراسة أجراها روبانوف وآخرون. [34] اقترح أن نحل العسل الذي يحتوي على وفرة نسبية أكبر من Lactobacillus كان لديه معدل انتشار أقل لعدوى Nosema. وبالمثل ، [50] وجد البحث أن نحل العسل الذي يحتوي على وفرة نسبية أكبر من Lactobacillus كان لديه معدل انتشار أقل لعدوى الطباشير.
علاوة على ذلك ، تم ربط عدوى Nosema ceranae أيضًا بالتغيرات في تنوع ميكروبيوم الأمعاء ، والتي قد يكون لها آثار ضارة على صحة نحل العسل بشكل عام وتزيد من القابلية للإصابة بأمراض أخرى. يمكن أن يساعد فهم التفاعلات بين عدوى Nosema ceranae وجراثيم الأمعاء في نحل العسل في تطوير استراتيجيات فعالة لإدارة هذا الطفيل ومكافحته. 2.
المواد والأساليب ============================= تم التأكد من إصابة النحل بمرض النوزيما أو الحضنة الطباشيرية بالطرق التجريبية واستخدمت كمجموعة تجارب للأمراض. تم تشخيص عدوى النوزيما من خلال طريقة الملاحظة المجهرية لبواغ نوزيما. يحتوي النحل المصاب بالنوزيما على جراثيم مغزلية الشكل في الأمعاء المتوسطة. تم تصنيف النحل مع ما لا يقل عن 1 × 106 جراثيم كمجموعة تجريبية مصابة بالنوزيما. يمكن تشخيص مرض الحضنة الطباشيرية بسهولة باستخدام طرق الكشف البصري. يبدو أن خلايا النحل المصابة بمرض الحضنة الطباشيرية تحتوي على مومياوات صلبة ومتقلصة تشبه الطباشير في الحضنة وتحيط بمدخل الخلية [38،51]. تم استخدام تقنية البيولوجيا الجزيئية (تفاعل البوليميراز المتسلسل ، PCR) للتمييز بين الحالة الصحية لنحل العسل [52،53]. تم التعرف على Nosemosis باستخدام طرق PCR الموصوفة سابقًا مع بادئات محددة لـ N. N. apis (حبلا الإحساس: 5 ′ CCA TTG CCG GAT AAG AGA GT 3 ، حبلا مضاد للحواس: 5 ′ CAC GCA TTG CTG CAT CAT TGAC 3 ′) (شركة بايونير ، دايجون ، جمهورية كوريا). تم تسخين كل PCR مسبقًا إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، مع مرحلة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. يمكن أيضًا تشخيص مرض الحضنة الطباشيرية (Ascosphaera apis) بسهولة باستخدام طريقة PCR مع بادئات محددة [39،54،55] (حبلا الإحساس: 5′-ACT CC CAC CCT TGT CTA CCT TA-3 ، حبلا مضاد: 5′- TCT TCG ACT GGA GTT CGT TTA TCT-3 ′) (شركة بايونير ، دايجون ، جمهورية كوريا). تم تسخين كل PCR مسبقًا إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، مع مرحلة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تم استخدام عدد متغير من الدورات لضمان حدوث التضخيم في المرحلة الخطية. تم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ وتصور بواسطة تلطيخ بروميد الإيثيديوم وتشعيع الأشعة فوق البنفسجية.
2.2. فحص الطباشير (CB)
تم استخراج الحمض النووي الجيني لفحص CB من قسامات متجانسة للنحل الكامل باستخدام DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة [27]. تم إجراء تقييم لإنتاج الحمض النووي ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 1000c (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). اكتمل تضخيم منطقة المباعد الداخلية المكتوبة (ITS) داخل وحدة تكرار الريبوسوم النووي للفطر Ascosphaera apis [56] ، وجين RpS5 من A. mellifera باستخدام PCR. تم إجراء جميع تضخمات PCR باستخدام 2 × Taq PCR MasterMix (abm ، Richmond ، BC ، كندا) ، في تفاعلات 25 ميكرولتر ، تحتوي على 400 نانومتر من كل تمهيدي ، تستهدف إما A. apis ITS أو A. mellifera RpS5. كانت شروط PCR كما يلي: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 62 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق [25]. تم إجراء تقييم منتج PCR على النحو الوارد أعلاه.
2.3عزل وتسلسل الحمض النووي
2.4 16S rRNA
التضخيم والتسلسل
تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للبكتيريا تم تنفيذ 16S rRNA المنطقة المتغيرة V3-V4 باستخدام الاشعال 341F (CCT ACG GGN GGC WGC AG) و 805R (GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC). تم قبول منطقة V3-V4 كمنطقة معرضة للخطأ منخفضة للتخصيص التصنيفي وتكتل المجتمع [60،61]. تم إجراء PCR عن طريق تمسخ أولي لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، و 30 دورة من 10 ثوان تمسخ عند 98 درجة مئوية ، و 30 دورة عند 55 درجة مئوية ، واستطالة 30 ثانية عند 72 درجة مئوية ، و 5 دقائق التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية. تم تنفيذ إجراء التسلسل باستخدام Illumina (Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إعداد المكتبة بواسطة بروتوكول إنشاء مكتبة قياسي (https://support.illumina.com/downloads/16s_metagenomic_sequencing_library_preparation.html (تم الوصول إليه في 12 ديسمبر 2022)) بواسطة مجموعة Nextera XT (Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم قياس كمية الأمبليكونات الخاصة بمنطقة V3-V4 في كل خليط تفاعل ومحول تسلسل Illumina. تم استخدام بادئات الفهرس (مجموعة Nextera XT Index) في مستحلب PCR لإنشاء مكتبات amplicon ، متبوعة بتنظيف PCR. تم قياس مكتبات MiSeq ثم تعريضها لتسلسل متعدد الأطراف من 300 نيوكليوتيد على جهاز تسلسل Illumina MiSeq. 2.5
تسلسل تحليلات البيانات أنتج مُسلسِل Illumina MiSeq قراءات خام مُفككة (PE) ، وتم الوصول إلى جودة القراءات بواسطة FastQC [62] وتوقيتها باستخدام Trimmomatic [63]. تم استيراد القراءات المعبأة المعبأة إلى الرؤى الكمية في Microbial Ecology 2 (QIIME2) لمزيد من التحليل. تم إجراء ترشيح الجودة والتشذيب وتقليل الضوضاء باستخدام q2-dada2 [64]. تم إجراء اشتقاق القراءة ، والتعلم من معدلات الخطأ ، واستدلال متغير تسلسل العينة مع العينات باستخدام DADA2. تم إجراء جدول متغير تسلسل amplicon (ASV) وإزالة الكيميرات باستخدام DADA2 ، متبوعًا بتخصيص التصنيف وتخصيص الأنواع باستخدام قاعدة بيانات DADA2 و SILVA v138.1 ([65] تم الوصول إليها في 15 أغسطس 2022). تم تحليل الثراء والتنوع البكتيري باستخدام مصفوفات تنوع ألفا وبيتا ومؤشرات مثل الميزة المرصودة ، مؤشر شانون ، مؤشر تشاو ، مؤشر ACE ، منحنيات Rarefaction ، مصفوفات مسافات Unifrac الموزونة وغير الموزونة ، ومؤامرات PcoA. تم استخدام GraphPad Prism 8 لإجراء تحليل إحصائي للنتائج التي تم الحصول عليها.
3.
النتائج والمناقشة 3.1.
التكافل الميكروبي في أمعاء نحل العسل يلعب التعايش الميكروبي وظيفة حيوية في أمعاء نحل العسل. يوضح الشكل 1. محتويات القناة الهضمية لنحل العسل المستخدم في التجربة. أظهرت نتائج التعايش الميكروبي في أمعاء نحل العسل أن ميكروبيوتا الأمعاء تلعب دورًا حاسمًا في الهضم ، والمناعة ، والصحة العامة في كلٍ من اللجنتين. مستويات الجنس. يدعم محتوى الأمعاء في النحل الضابط النمو البكتيري النافع ، بسبب الحموضة المعتدلة (درجة الحموضة 6.0-6.5) ووجود الأنشطة الأنزيمية [4] ، مما يدل على كفاءة تكسير وامتصاص المغذيات [24]. تتكون الميكروبات المعوية لنحل العسل من مجموعة أساسية من الأنواع البكتيرية ، التي تنتمي بشكل أساسي إلى البكتيريا المتشكلة والشعبية [4،5]. وهذا بدوره يدعم صحة النحل بشكل عام ورفاهية الطائفة. مسببات الأمراض 12 00734 جم 001 550 الشكل 1. تشريح الجهاز الهضمي لكل من (أ) السيطرة ، (ب) نوزيما ، (ج) حضنة الطباشير ، و (د) نحل العسل الضعيف. يتم تشريح نحل العسل واستخدام محتويات القناة الهضمية للتحليل. 3.2 !
التحليل التصنيفي لتسلسل البيانات تم تحليل التسلسلات التي تم إنشاؤها للعينات الملوثة والعينات الضابطة باستخدام أدوات QIIME2 التي تولد 1،353،431 ترددًا إجماليًا بمتوسط 42،294 OUT لكل عينة. تم تحليل ودراسة المواقف التصنيفية للقراءات المتسلسلة باستخدام مصنف SILVA ، مع التصنيف بناءً على تسلسل الجينات الرنا الريباسي 16S. يقترح التحليل أن 98٪ من القراءات تنتمي إلى المملكة البكتيرية ؛ قراءات أخرى حذفت من مزيد من التحليل. نظرًا لاستخدام 16S rRNA على نطاق واسع في الدراسات التصنيفية والتطور نظرًا لتسلسلاتها المحفوظة للغاية ، يمكن أيضًا استخدام منطقتها شديدة التغير لإجراء تقييم تصنيفي دقيق. فضل نحل العسل المصاب بنوسيما سيرانا عسل عباد الشمس على عسل المن في اختبارات الاختيار المزدوج. عسل عباد الشمس كان له نشاط مضاد للميكروبات أعلى وقلل من كمية جراثيم N. ceranae في أمعاء النحل [56]. تعد أمعاء نحل العسل موطنًا للبكتيريا المضادة للطفيليات مثل Ascosphaera apis [66،67]. قد توفر مثل هذه التفاعلات العدائية وسيلة لعلاج الأمراض. على سبيل المثال ، أدى تلقيح مستعمرات النحل ببكتيريا Parasaccharibacter apium إلى انخفاض مستويات عدوى Nosema ceranae [68].
3.3
ميكروبيوم نحل العسل المصاب المجتمع البكتيري الرئيسي هو من phyla Proteobacteria and Firmicutes (الشكل 2 والجدول التكميلي S1) ، والتي تختلف اختلافًا كبيرًا عن أحشاء نحل الطباشير. الأنواع البكتيرية التي تنتمي إلى جنس Gilliamella و Lactobacillus و Snodgrassella و Frischella و Bombella هي السائدة tly الموجودة في أمعاء نحل العسل المصاب بالنوزيما (الشكل 3). العوامل الممرضة 12 00734 g002 550 الشكل 2. مقارنة على مستوى الشعبة بين المجتمعات البكتيرية Nosema و Chalkbrood ومجتمعات أمعاء نحل العسل الضعيفة. العوامل الممرضة 12 00734 g003 550 الشكل 3. مقارنة مستوى الجنس بين المجتمعات البكتيرية Nosema و Chalkbrood ومجتمعات أمعاء نحل العسل الضعيفة. تعد البكتيريا المتقلبة والثبات من الأنواع الرئيسية للبكتيريا الموجودة في بكتيريا أمعاء نحل العسل. معًا ، غالبًا ما يشكلون غالبية الأنواع البكتيرية الموجودة في أمعاء نحل العسل. تُظهر الخريطة الحرارية لاستجابة بنية المجتمع البكتيري على مستوى الشعبة (الشكل 4) تنوع البكتيريا الموجودة في أربع عينات مختلفة من الأمعاء من نحل العسل. البكتيريا المتقلبة هي بكتيريا سالبة الجرام وتشمل مجموعة متنوعة من البكتيريا ذات القدرات الأيضية المختلفة. يلعبون أدوارًا مهمة في هضم العناصر الغذائية وتنظيم جهاز المناعة والحماية من مسببات الأمراض. بعض العائلات الشائعة من البكتيريا الموجودة في أمعاء نحل العسل تشمل البكتريا Acetobacteraceae و Enterobacteriaceae و Pseudomonadaceae. العوامل الممرضة 12 00734 g004 550 الشكل 4. خريطة حرارية للتنوع البكتيري المرتبط بالنوزيما والحضنة الطباشيرية وأمعاء نحل العسل الضعيفة مقارنة بالتحكم الصحي.
استنادًا إلى مؤشر تحويل ألفا (الشكل 5 والجدول التكميلي S3) ، تؤوي أمعاء نحل العسل المصابة بحضنة الطباشير وحدات OTU أعلى بكثير مقارنة بالمجموعات الثلاث الأخرى ، كما تُظهر تنوعًا كبيرًا في البكتيريا مقارنة بالمجموعات الأخرى. العوامل الممرضة 12 00734 g005 550 الشكل 5. مقارنة مؤشرات تنوع ألفا (A) لاحظت OTUs ، (B) مؤشر ACE ، (C) مؤشر تنوع Shannon ، و (D) مؤشر Simpson بين أربع مجموعات مختلفة. تظهر أمعاء نحل العسل المصابة بداء الطباشير فروقًا ذات دلالة إحصائية بين المجموعات.
التنوع البكتيري أعلى بشكل ملحوظ في أمعاء نحل العسل المصابة بحضنة الطباشير مقارنة بنحل العسل الآخر. تكون تركيبة نوزيما صحية وميكروبيوم نحل عسل ضعيف أقل بكثير من نحل العسل المصاب بحضنة الطباشير ، والذي لوحظ أيضًا في مؤشر تنوع شانون وسيمبسون. يوضح مخطط Venn المجتمع الميكروبي المشترك بين العينات (الشكل 6). يحتوي نحل العسل المصاب بالنوزيما على أقل عدد من وحدات OTU الفريدة والشاملة مقارنة بالمجموعات الأخرى. العوامل الممرضة 12 00734 g006 550 الشكل 6. مخطط Venn رباعي الاتجاهات يوضح عدد وحدات OTU الفريدة المشتركة عند مستوى القطع 0.03 بين عينات أمعاء نحل العسل. تحتوي عينات الطباشير على أعلى تنوع OTU وأكبر عدد من OTUs الفريدة.
أظهر نحل العسل المصاب بحضنة الطباشير أكثر وحدات OTU البكتيرية الفريدة مقارنة بنحل العسل النزيما الضعيف والمسيطر عليه. تظهر أمعاء نحل العسل الضابطة الوجود المهيمن للجيلياميلا ، واللاكتوباسيلوس ، والفريشيلا ، والسنودجراسيلا ، والآسايا ، بينما أظهر نحل العسل المصاب بالنوزيما وجود الجيلياميلا ، واللاكتوباسيلوس ، والفريشيلا ، والسنودجراسيلا ، والبكتيريا المعوية ، والعائلة الفرانكونية ، وأعضاء الفصيلة المعوية. (الشكل 1 والجدول التكميلي S2). أظهر نحل العسل الضعيف وجود أجناس Gilliamella و Lactobacillus و Frischella و Snodgrassella و Pantoea وأفراد عائلة Enterobacteriaceae. في غضون ذلك ، يُظهر نحل العسل المصاب بحضنة الطباشير وجود Lactobacillus و Pseudoflavonifractor و Alistipes و Oscillibacter و Paenibacillus وثلاثة أجناس بكتيرية غير معروفة باعتبارها الأجناس السائدة.
4 -
نتائج كان التركيز الأساسي للدراسة هو تحليل ومقارنة المجتمعات البكتيرية الموجودة في أمعاء نحل العسل المصابة بـ Ascosphaera apis ، ومقارنة هذه النتائج مع تلك الموجودة في نحل العسل المصاب بالنوزيما سيرانا والضعيف النشط. في حالة نحل العسل المصاب بالنوزيما ، تم العثور على مجموعة Proteobacteria مهيمنة بشكل كبير داخل المجتمع البكتيري ، وهي خاصية لوحظت أيضًا في نحل العسل ضعيف النشاط. ومع ذلك ، عند فحص نحل العسل المصاب بـ Ascosphaera (Chalkbrood) ، تباينت التركيبة البكتيرية إلى حد كبير ، حيث وجد أن هذا النحل يحتوي على كميات كبيرة من المواد الصلبة ، بدلاً من البكتيريا المتقلبة.
يوجد جنس Lactobacillus في الغالب في جميع المجموعات الأربع من أحشاء نحل العسل ، بغض النظر عن العدوى أو الضعف. توجد أجناس Gilliamella و Frischella و Snodgrassella في أحشاء نحل العسل الضعيفة والضعيفة والسيطرة ، ولكنها ليست موجودة بشكل كبير في نحل العسل المصاب بداء الطباشير. هذا يدل على أن هذه الأجناس الثلاثة تتأثر بشكل كبير بعدوى Ascosphaera apis في نحل العسل. أظهرت الدراسات أن نحل العسل المصاب بـ Nosema ceranae له تنوع جرثومي منخفض في الأمعاء وتغير في بنية المجتمع الميكروبي. على وجه التحديد ، وجد أن انتشار أصناف بكتيرية معينة ، مثل Lactobacillus و Bifidobacterium ، ينخفض في النحل المصاب. هذه البكتيريا مهمة للحفاظ على بيئة أمعاء صحية والمساعدة في الهضم. قد يؤدي انخفاض تنوع بكتيريا الأمعاء وتغير بنية المجتمع الميكروبي إلى هكتار خمس عواقب سلبية على صحة وبقاء نحل العسل. على سبيل المثال ، يمكن لبكتيريا الأمعاء المعطلة أن تجعل نحل العسل أكثر عرضة لمسببات الأمراض الأخرى والضغوط البيئية. تم العثور على جنس Lactobacillus باستمرار في أمعاء نحل العسل في جميع المجموعات الأربع ، بغض النظر عن حالة العدوى أو الضعف [49]. علاوة على ذلك ، لوحظت أجناس Gilliamella و Frischella و Snodgrassella في أحشاء نحل العسل المصاب بالنوزيما والضعيف والسيطرة ، ولكنها غير موجودة بشكل كبير في نحل العسل المصاب بداء الطباشير. تشير هذه النتيجة إلى أن هذه الأجناس الثلاثة قد تأثرت بشكل كبير بعدوى Ascosphaera apis في نحل العسل [49]. أظهر البحث أن نحل العسل المصاب بـ Nosema ceranae يُظهر تنوعًا منخفضًا في البكتيريا المعوية وتغيرًا في بنية المجتمع الميكروبي [2]. على وجه التحديد ، يتناقص انتشار بعض الأصناف البكتيرية ، مثل Lactobacillus و Bifidobacterium ، في النحل المصاب. هذه البكتيريا ضرورية للحفاظ على بيئة أمعاء صحية ودعم الهضم. قد يؤثر الانخفاض في تنوع بكتيريا الأمعاء وتغير بنية المجتمع الميكروبي سلبًا على صحة نحل العسل وبقائه على قيد الحياة. على سبيل المثال ، يمكن أن تزيد بكتيريا الأمعاء المعطلة من قابلية نحل العسل لمسببات الأمراض الأخرى والضغوط البيئية.
هناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم الأدوار المحددة لهذه البكتيريا في الأمعاء. تؤدي عدوى Ascosphaera apis في نحل العسل بشكل ساخر إلى تغيير بنية المجتمع البكتيري في القناة الهضمية ، والتي يمكن تأكيدها أيضًا من خلال تحليل التنوع بيتا (الشكلان التكميليان S1 و S2) باستخدام شجرة UPGMA النشوءية وتحليل PCoA. بشكل عام ، فإن تأثير عدوى Nosema ceranae و Ascosphaera apis على بكتيريا الأمعاء في نحل العسل يسلط الضوء على الطبيعة المعقدة والمترابطة للمجتمعات الميكروبية في صحة نحل العسل ويؤكد على أهمية دراسة هذه التفاعلات لفهم مجموعات نحل العسل وحمايتها بشكل أفضل.
* ORCID
المؤلفون 1 كلية الصيدلة ، جامعة Chungbuk الوطنية ، Chungbuk 28160 ،
جمهورية كوريا 2 قسم التكنولوجيا الحيوية والبيئية ، كلية العلوم الطبيعية ، جامعة سيول النسائية ، سيول 01797 ، جمهورية كوريا 3 قسم العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا 4 قسم تعليم الأحياء ، كلية التربية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا * المؤلفون الذين يجب توجيه المراسلات إليهم. † ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل. مسببات الأمراض 2023 ، 12 (5) ، 734 ؛ https://doi.org/10.3390/pathogens12050734 تم الاستلام: 30 آذار (مارس) 2023 / المنقح: 11 أيار (مايو) 2023 / مقبول: 12 أيار (مايو) 2023 / تاريخ ا المواد التكميلية يمكن تنزيل المعلومات الداعمة التالية على: https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12050734/s1. الجدول التكميلي S1: تكوين المجتمع البكتيري على مستوى الشعبة. يتم عرض الوفرة النسبية المئوية للأنواع البكتيرية على مستوى الشعبة للعينات. الوفرة النسبية <1٪ عبر جميع العينات موضحة على أنها "أخرى" ؛ الجدول التكميلي S2: تكوين المجتمع البكتيري على مستوى الجنس. يتم عرض الوفرة النسبية المئوية للأصناف البكتيرية على مستوى الجنس للعينات. الوفرة النسبية <1٪ عبر جميع العينات موضحة على أنها "أخرى" ؛ الجدول التكميلي S3: مؤشرات تنوع ألفا ؛ الشكل التكميلي S1: شجرة النشوء والتطور UPGMA بناءً على مسافة unifrac الموزونة عبر العينات. تم تجميع التسلسلات بالتساوي عبر عينات فردية (35000 تسلسل لكل عينة) قبل التحليل ؛ الشكل التكميلي S2: مخطط PCoA لتنوع بيتا في بكتيريا الأمعاء بناءً على مسافات Unifrac المرجحة لنحل العسل. تمثل كل نقطة بيانات عينة فردية. تم تجميع التسلسلات بالتساوي عبر عينات فردية (35000 تسلسل لكل عينة) قبل التحليل. الكاتب الاشتراكات * ORCID 1 كلية الصيدلة ، جامعة Chungbuk الوطنية ، Chungbuk 28160 ، جمهورية كوريا 2 قسم التكنولوجيا الحيوية والبيئية ، كلية العلوم الطبيعية ، جامعة سيول النسائية ، سيول 01797 ، جمهورية كوريا 3 قسم العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا 4 قسم تعليم الأحياء ، كلية التربية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا *
المؤلفون الذين يجب توجيه المراسلات إليهم. †
ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل. مسببات الأمراض 2023 ، 12 (5) ، 734 ؛ https://doi.org/10.3390/pathogens12050734 تم الاستلام: 30 آذار (مارس) 2023 / المنقح: 11 أيار (مايو) 2023 / مقبول: 12 أيار (مايو) 2023 / تاريخ
ا
بواسطة الكلمات الرئيسية: نحل العسل؛ نوزيما سيرانا أبيس ميليفيرا نوزيموسيس. الحضنة الطباشيرية. Ascosphaera apis 1
المقدمة تنتج مستعمرات النحل غالبية 57 محصولًا أساسيًا للاستهلاك البشري ، مما يجعلها أكثر الملقحات التي تتم إدارتها في العالم [1،2،3]. يشكل تدهور نحل العسل تهديدًا خطيرًا لإنتاجية واستقرار الزراعة العالمية. تعد الطفيليات بالفعل أحد العوامل المسببة لهذه الانخفاضات. يمكن أن تختلف تركيبة بكتيريا أمعاء نحل العسل ، اعتمادًا على عوامل مختلفة مثل الجغرافيا ، والنظام الغذائي ، والموسم ، وممارسات الإدارة [4]. ومع ذلك ، فإن بعض الأنواع البكتيرية الشائعة الموجودة في أمعاء نحل العسل تشمل Lactobacillus و Bifidobacterium و Gilliamella. تلعب هذه البكتيريا أدوارًا مهمة في هضم العناصر الغذائية وامتصاصها ، وتنظيم جهاز المناعة ، والحماية من مسببات الأمراض [5]. اشتدت أزمات الأمراض في نحل العسل في السنوات الأخيرة ، ويتم إيلاء اهتمام متزايد لمعالجة هذه القضية. على مدى السنوات العديدة الماضية ، كانت هناك خسائر سنوية تتراوح بين 30٪ و 40٪ من جميع مستعمرات نحل العسل الأمريكية المُدارة [6،7،8]. بالإضافة إلى الفيروسات والبكتيريا والميكروسبوريديا والمفصليات ، فإن مجموعة متنوعة من الطفيليات تشكل مخاطر جسيمة على نحل العسل [1،9،10].
الأمراض الفيروسية التي تسبب مشاكل للنحل تشمل فيروس نحل كشمير ، فيروس شلل النحل الحاد (ABPV) ، فيروس الجناح المشوه (DWV) ، فيروس خلية الملكة السوداء (BQCV) ، فيروس شلل النحل الحاد (ABPV) ، فيروس الجناح المشوه (DWV). ) [11]. دمار الفاروا هو عث طفيلي يشكل تهديدًا كبيرًا لتعداد نحل العسل في جميع أنحاء العالم [12]. تتغذى هذه العث على الدملمف (سائل الدورة الدموية) لكل من نحل العسل البالغ والحضنات النامية ، مما يسبب ضررًا جسديًا ويضعف النحل [13]. لا تؤدي الإصابة بالعث إلى تدهور صحة النحل الفردية فحسب ، بل يمكنها أيضًا تسهيل انتقال فيروسات نحل العسل المختلفة ، مما يؤدي إلى تفاقم انهيار الطائفة [14]. تم الإبلاغ عن مرض الحضنة الأمريكية (AFB) و الحضنة الأوروبية (EFB) كأمراض بكتيرية ، و Nosema كمرض أولي ، و Chalkbrood و Stonebrood كأمراض فطرية [15،16،17]. من بين هذه الأمراض ، يعد مرض Nosemosis و Chalkbrood من أخطر الأمراض في جمهورية كوريا [18].
يعتمد نحل العسل على مجتمع متنوع من الميكروبات للمساعدة في الهضم والتغذية والحماية من مسببات الأمراض. تتكون الأمعاء المطورة لأمعاء نحل العسل العاملة من أربعة متعايشات بكتيرية أساسية توجد بشكل أساسي في المعى الخلفي: Snodgrassella alvi و Gilliamella apicola و Lactobacillus و Bifidobacterium asteroides [5،19]. يتم الحصول على هذه المكونات داخل مستعمرة المنزل ويتم إنشاؤها بشكل أساسي بعد 9 أيام من خروج النحلة من الخلية [20،21]. تنتشر بكتيريا الأمعاء الأخرى بشكل متكرر ، ولكن انتشارها أقل نسبيًا وبتماسك أقل عبر النحل والمستعمرات. تحدث العديد من عمليات التمثيل الغذائي في المعى الخلفي ، خاصة في سياق تكافلي. من المتعايشات البكتيرية الأساسية ، G. apicola و Bifidobacterium و Lactobacillus هي مخمرات كربوهيدراتية تدعم منتجاتها الأيضية نمو S. alvi [22،23]. من المحتمل أيضًا أن تدعم هذه المستقلبات المشتقة من التعايش صحة النحل عن طريق الامتصاص المعوي. تم دعم هذه النتائج من خلال دراسات التغذية الميكروبية التي تركز على العمليات الفسيولوجية للنحل ، وشروح الميتاجينوم للمتعايشين [4،24]. يقع المعى المتوسط في أعلى مجرى المعى الخلفي. المعي المتوسط لنحل العسل هو النقطة المحورية لهضم وامتصاص العناصر الغذائية. يحتوي على إنزيمات هضمية من بطانة الخلية ، بالإضافة إلى الإنزيمات التي يتم إفرازها ونقلها من الغدد البلعومية [25 ، 26]. كما أن المعى المتوسط مبطن بمصفوفة بيريتروفيك ، وهي عبارة عن حاجز وقائي. بالنسبة إلى المعى الخلفي ، فإن المعى المتوسط خالي من البكتيريا ، ربما بسبب إعادة الترتيب المستمر للمصفوفة المحيطة [20]. يُعتقد أن المعى المتوسط للنحل يأوي الخمائر التي تقدم أدوارًا إضافية في الجهاز الهضمي ، كما هو شائع في الحشرات الأخرى [27]. يشير هذا إلى أنه من المحتمل أن يكون للخمائر طريقة بديلة للارتباط / الاستعمار في هذه البيئة التي تفتقر إليها البكتيريا [22].
منذ اكتشافه في عام 1909 ، يُنظر إلى Nosemosis على أنه مرض موسمي له تأثير سلبي على أرباح تربية النحل. يصيب طفيلي ميكروسبوريدي يسمى نوزيما سيرانا نحل العسل ويمكن أن يضر بشكل خطير مستعمرات نحل العسل [28،29]. أظهرت الأبحاث أن عدوى نوزيما سيرانا يمكن أن تغير تكوين بكتيريا أمعاء نحل العسل ، مما يتسبب في وفرة وتناقص البكتيريا المفيدة مثل العصيات اللبنية وزيادة البكتيريا الضارة المحتملة مثل المكورات المعوية [30،31]. في الربيع ، يشعر الكثيرون بالإرهاق وبسبب تأثيرات Nosemosis ، يتم اكتشاف نحل ميت في جميع أنحاء خلايا النحل [32].
أكثر مسببات الأمراض حقيقية النواة انتشارًا في نحل العسل هي نوزيما سيرانا. على الرغم من أن العدوى عادة ما تكون مزمنة ، إلا أنها قد تكون قاتلة أيضًا. ربطت الأبحاث الحديثة بين تطور أمراض الأمعاء المعدية وميكروبات الأمعاء [21،33]. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات وجدت ارتباطات إيجابية وليست سلبية بين عدوى نوزيما سيرانا والبكتيريا الرئيسية في ميكروبات نحل العسل [34]. تعتبر ميكروبيوتا الأمعاء في نحل العسل أساسية وتتكون بشكل أساسي من عدد قليل من الأنواع البكتيرية الرئيسية. لا يوجد الكثير من بكتيريا الأمعاء في الأمعاء الوسطى ، ربما بسبب التجدد المستمر للغشاء الصفاق [35،36،37].
أحد مسببات الأمراض الفطرية Ascosphaera apis يصيب يرقات نحل العسل ، مسبباً مرضاً يعرف باسم الحضنة الطباشيرية [38]. بينما أظهرت الأبحاث أن الحضنة الطباشيرية يمكن أن يكون لها تأثيرات كبيرة على صحة نحل العسل ، هناك معلومات أقل عن التأثيرات المحددة لـ Ascosphaera apis على تغيير تكوين بكتيريا الأمعاء في نحل العسل [39،40]. على العكس من ذلك ، فقد بحثت بعض الدراسات في تأثير مرض الحضنة الطباشيرية (الناجم عن كل من Ascosphaera apis و Ascosphaera larvis) على ميكروبيوم الأمعاء ليرقات نحل العسل. على سبيل المثال ، قللت اليرقات المصابة بدم الطباشير من مستويات بعض الأنواع البكتيرية المفيدة ، مثل Lactobacillus و Bifidobacterium ، في أمعائها مقارنة باليرقات السليمة [40،41،42]. وجدت الدراسة أيضًا زيادة في وفرة البكتيريا التي يحتمل أن تكون ضارة مثل Enterobacter و Pseudomonas في اليرقات المصابة بدمأة الطباشير [43]. المواد الصلبة هي بكتيريا موجبة الجرام وتشمل مجموعة متنوعة من البكتيريا ، والتي يوجد بعضها بشكل شائع في أمعاء نحل العسل [44]. من المعروف أنها تلعب أدوارًا مهمة في هضم العناصر الغذائية وتنظيم جهاز المناعة والحماية من مسببات الأمراض. بعض عائلات الثبات الشائعة الموجودة في أمعاء نحل العسل تشمل العصيات اللبنية ، العصوية ، والمكورات العقدية [44 ، 45 ، 46]. أشارت الدراسات إلى أن الوفرة النسبية المرتفعة من المواد القوية ترتبط بصحة أفضل لنحل العسل ومقاومة أكبر للأمراض مثل مرض الحضنة الأمريكية ، في حين أن الوفرة النسبية العالية من البكتيريا المتقلبة ترتبط بزيادة القابلية للإصابة بأمراض معينة [5،47]. اقترحت العديد من الدراسات أن Lactobacillus قد تلعب دورًا وقائيًا ضد عدوى Nosema و Chalkbrood في نحل العسل [48 ، 49]. على سبيل المثال ، دراسة أجراها روبانوف وآخرون. [34] اقترح أن نحل العسل الذي يحتوي على وفرة نسبية أكبر من Lactobacillus كان لديه معدل انتشار أقل لعدوى Nosema. وبالمثل ، [50] وجد البحث أن نحل العسل الذي يحتوي على وفرة نسبية أكبر من Lactobacillus كان لديه معدل انتشار أقل لعدوى الطباشير.
علاوة على ذلك ، تم ربط عدوى Nosema ceranae أيضًا بالتغيرات في تنوع ميكروبيوم الأمعاء ، والتي قد يكون لها آثار ضارة على صحة نحل العسل بشكل عام وتزيد من القابلية للإصابة بأمراض أخرى. يمكن أن يساعد فهم التفاعلات بين عدوى Nosema ceranae وجراثيم الأمعاء في نحل العسل في تطوير استراتيجيات فعالة لإدارة هذا الطفيل ومكافحته. 2.
المواد والأساليب ============================= تم التأكد من إصابة النحل بمرض النوزيما أو الحضنة الطباشيرية بالطرق التجريبية واستخدمت كمجموعة تجارب للأمراض. تم تشخيص عدوى النوزيما من خلال طريقة الملاحظة المجهرية لبواغ نوزيما. يحتوي النحل المصاب بالنوزيما على جراثيم مغزلية الشكل في الأمعاء المتوسطة. تم تصنيف النحل مع ما لا يقل عن 1 × 106 جراثيم كمجموعة تجريبية مصابة بالنوزيما. يمكن تشخيص مرض الحضنة الطباشيرية بسهولة باستخدام طرق الكشف البصري. يبدو أن خلايا النحل المصابة بمرض الحضنة الطباشيرية تحتوي على مومياوات صلبة ومتقلصة تشبه الطباشير في الحضنة وتحيط بمدخل الخلية [38،51]. تم استخدام تقنية البيولوجيا الجزيئية (تفاعل البوليميراز المتسلسل ، PCR) للتمييز بين الحالة الصحية لنحل العسل [52،53]. تم التعرف على Nosemosis باستخدام طرق PCR الموصوفة سابقًا مع بادئات محددة لـ N. N. apis (حبلا الإحساس: 5 ′ CCA TTG CCG GAT AAG AGA GT 3 ، حبلا مضاد للحواس: 5 ′ CAC GCA TTG CTG CAT CAT TGAC 3 ′) (شركة بايونير ، دايجون ، جمهورية كوريا). تم تسخين كل PCR مسبقًا إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، مع مرحلة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. يمكن أيضًا تشخيص مرض الحضنة الطباشيرية (Ascosphaera apis) بسهولة باستخدام طريقة PCR مع بادئات محددة [39،54،55] (حبلا الإحساس: 5′-ACT CC CAC CCT TGT CTA CCT TA-3 ، حبلا مضاد: 5′- TCT TCG ACT GGA GTT CGT TTA TCT-3 ′) (شركة بايونير ، دايجون ، جمهورية كوريا). تم تسخين كل PCR مسبقًا إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، مع مرحلة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تم استخدام عدد متغير من الدورات لضمان حدوث التضخيم في المرحلة الخطية. تم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ وتصور بواسطة تلطيخ بروميد الإيثيديوم وتشعيع الأشعة فوق البنفسجية.
2.2. فحص الطباشير (CB)
تم استخراج الحمض النووي الجيني لفحص CB من قسامات متجانسة للنحل الكامل باستخدام DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة [27]. تم إجراء تقييم لإنتاج الحمض النووي ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 1000c (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). اكتمل تضخيم منطقة المباعد الداخلية المكتوبة (ITS) داخل وحدة تكرار الريبوسوم النووي للفطر Ascosphaera apis [56] ، وجين RpS5 من A. mellifera باستخدام PCR. تم إجراء جميع تضخمات PCR باستخدام 2 × Taq PCR MasterMix (abm ، Richmond ، BC ، كندا) ، في تفاعلات 25 ميكرولتر ، تحتوي على 400 نانومتر من كل تمهيدي ، تستهدف إما A. apis ITS أو A. mellifera RpS5. كانت شروط PCR كما يلي: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 62 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق [25]. تم إجراء تقييم منتج PCR على النحو الوارد أعلاه.
2.3
التضخيم والتسلسل
تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للبكتيريا تم تنفيذ 16S rRNA المنطقة المتغيرة V3-V4 باستخدام الاشعال 341F (CCT ACG GGN GGC WGC AG) و 805R (GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC). تم قبول منطقة V3-V4 كمنطقة معرضة للخطأ منخفضة للتخصيص التصنيفي وتكتل المجتمع [60،61]. تم إجراء PCR عن طريق تمسخ أولي لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، و 30 دورة من 10 ثوان تمسخ عند 98 درجة مئوية ، و 30 دورة عند 55 درجة مئوية ، واستطالة 30 ثانية عند 72 درجة مئوية ، و 5 دقائق التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية. تم تنفيذ إجراء التسلسل باستخدام Illumina (Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إعداد المكتبة بواسطة بروتوكول إنشاء مكتبة قياسي (https://support.illumina.com/downloads/16s_metagenomic_sequencing_library_preparation.html (تم الوصول إليه في 12 ديسمبر 2022)) بواسطة مجموعة Nextera XT (Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم قياس كمية الأمبليكونات الخاصة بمنطقة V3-V4 في كل خليط تفاعل ومحول تسلسل Illumina. تم استخدام بادئات الفهرس (مجموعة Nextera XT Index) في مستحلب PCR لإنشاء مكتبات amplicon ، متبوعة بتنظيف PCR. تم قياس مكتبات MiSeq ثم تعريضها لتسلسل متعدد الأطراف من 300 نيوكليوتيد على جهاز تسلسل Illumina MiSeq. 2.5
تسلسل تحليلات البيانات أنتج مُسلسِل Illumina MiSeq قراءات خام مُفككة (PE) ، وتم الوصول إلى جودة القراءات بواسطة FastQC [62] وتوقيتها باستخدام Trimmomatic [63]. تم استيراد القراءات المعبأة المعبأة إلى الرؤى الكمية في Microbial Ecology 2 (QIIME2) لمزيد من التحليل. تم إجراء ترشيح الجودة والتشذيب وتقليل الضوضاء باستخدام q2-dada2 [64]. تم إجراء اشتقاق القراءة ، والتعلم من معدلات الخطأ ، واستدلال متغير تسلسل العينة مع العينات باستخدام DADA2. تم إجراء جدول متغير تسلسل amplicon (ASV) وإزالة الكيميرات باستخدام DADA2 ، متبوعًا بتخصيص التصنيف وتخصيص الأنواع باستخدام قاعدة بيانات DADA2 و SILVA v138.1 ([65] تم الوصول إليها في 15 أغسطس 2022). تم تحليل الثراء والتنوع البكتيري باستخدام مصفوفات تنوع ألفا وبيتا ومؤشرات مثل الميزة المرصودة ، مؤشر شانون ، مؤشر تشاو ، مؤشر ACE ، منحنيات Rarefaction ، مصفوفات مسافات Unifrac الموزونة وغير الموزونة ، ومؤامرات PcoA. تم استخدام GraphPad Prism 8 لإجراء تحليل إحصائي للنتائج التي تم الحصول عليها.
3.
النتائج والمناقشة 3.1.
التكافل الميكروبي في أمعاء نحل العسل يلعب التعايش الميكروبي وظيفة حيوية في أمعاء نحل العسل. يوضح الشكل 1. محتويات القناة الهضمية لنحل العسل المستخدم في التجربة. أظهرت نتائج التعايش الميكروبي في أمعاء نحل العسل أن ميكروبيوتا الأمعاء تلعب دورًا حاسمًا في الهضم ، والمناعة ، والصحة العامة في كلٍ من اللجنتين. مستويات الجنس. يدعم محتوى الأمعاء في النحل الضابط النمو البكتيري النافع ، بسبب الحموضة المعتدلة (درجة الحموضة 6.0-6.5) ووجود الأنشطة الأنزيمية [4] ، مما يدل على كفاءة تكسير وامتصاص المغذيات [24]. تتكون الميكروبات المعوية لنحل العسل من مجموعة أساسية من الأنواع البكتيرية ، التي تنتمي بشكل أساسي إلى البكتيريا المتشكلة والشعبية [4،5]. وهذا بدوره يدعم صحة النحل بشكل عام ورفاهية الطائفة. مسببات الأمراض 12 00734 جم 001 550 الشكل 1. تشريح الجهاز الهضمي لكل من (أ) السيطرة ، (ب) نوزيما ، (ج) حضنة الطباشير ، و (د) نحل العسل الضعيف. يتم تشريح نحل العسل واستخدام محتويات القناة الهضمية للتحليل. 3.2 !
التحليل التصنيفي لتسلسل البيانات تم تحليل التسلسلات التي تم إنشاؤها للعينات الملوثة والعينات الضابطة باستخدام أدوات QIIME2 التي تولد 1،353،431 ترددًا إجماليًا بمتوسط 42،294 OUT لكل عينة. تم تحليل ودراسة المواقف التصنيفية للقراءات المتسلسلة باستخدام مصنف SILVA ، مع التصنيف بناءً على تسلسل الجينات الرنا الريباسي 16S. يقترح التحليل أن 98٪ من القراءات تنتمي إلى المملكة البكتيرية ؛ قراءات أخرى حذفت من مزيد من التحليل. نظرًا لاستخدام 16S rRNA على نطاق واسع في الدراسات التصنيفية والتطور نظرًا لتسلسلاتها المحفوظة للغاية ، يمكن أيضًا استخدام منطقتها شديدة التغير لإجراء تقييم تصنيفي دقيق. فضل نحل العسل المصاب بنوسيما سيرانا عسل عباد الشمس على عسل المن في اختبارات الاختيار المزدوج. عسل عباد الشمس كان له نشاط مضاد للميكروبات أعلى وقلل من كمية جراثيم N. ceranae في أمعاء النحل [56]. تعد أمعاء نحل العسل موطنًا للبكتيريا المضادة للطفيليات مثل Ascosphaera apis [66،67]. قد توفر مثل هذه التفاعلات العدائية وسيلة لعلاج الأمراض. على سبيل المثال ، أدى تلقيح مستعمرات النحل ببكتيريا Parasaccharibacter apium إلى انخفاض مستويات عدوى Nosema ceranae [68].
3.3
ميكروبيوم نحل العسل المصاب المجتمع البكتيري الرئيسي هو من phyla Proteobacteria and Firmicutes (الشكل 2 والجدول التكميلي S1) ، والتي تختلف اختلافًا كبيرًا عن أحشاء نحل الطباشير. الأنواع البكتيرية التي تنتمي إلى جنس Gilliamella و Lactobacillus و Snodgrassella و Frischella و Bombella هي السائدة tly الموجودة في أمعاء نحل العسل المصاب بالنوزيما (الشكل 3). العوامل الممرضة 12 00734 g002 550 الشكل 2. مقارنة على مستوى الشعبة بين المجتمعات البكتيرية Nosema و Chalkbrood ومجتمعات أمعاء نحل العسل الضعيفة. العوامل الممرضة 12 00734 g003 550 الشكل 3. مقارنة مستوى الجنس بين المجتمعات البكتيرية Nosema و Chalkbrood ومجتمعات أمعاء نحل العسل الضعيفة. تعد البكتيريا المتقلبة والثبات من الأنواع الرئيسية للبكتيريا الموجودة في بكتيريا أمعاء نحل العسل. معًا ، غالبًا ما يشكلون غالبية الأنواع البكتيرية الموجودة في أمعاء نحل العسل. تُظهر الخريطة الحرارية لاستجابة بنية المجتمع البكتيري على مستوى الشعبة (الشكل 4) تنوع البكتيريا الموجودة في أربع عينات مختلفة من الأمعاء من نحل العسل. البكتيريا المتقلبة هي بكتيريا سالبة الجرام وتشمل مجموعة متنوعة من البكتيريا ذات القدرات الأيضية المختلفة. يلعبون أدوارًا مهمة في هضم العناصر الغذائية وتنظيم جهاز المناعة والحماية من مسببات الأمراض. بعض العائلات الشائعة من البكتيريا الموجودة في أمعاء نحل العسل تشمل البكتريا Acetobacteraceae و Enterobacteriaceae و Pseudomonadaceae. العوامل الممرضة 12 00734 g004 550 الشكل 4. خريطة حرارية للتنوع البكتيري المرتبط بالنوزيما والحضنة الطباشيرية وأمعاء نحل العسل الضعيفة مقارنة بالتحكم الصحي.
استنادًا إلى مؤشر تحويل ألفا (الشكل 5 والجدول التكميلي S3) ، تؤوي أمعاء نحل العسل المصابة بحضنة الطباشير وحدات OTU أعلى بكثير مقارنة بالمجموعات الثلاث الأخرى ، كما تُظهر تنوعًا كبيرًا في البكتيريا مقارنة بالمجموعات الأخرى. العوامل الممرضة 12 00734 g005 550 الشكل 5. مقارنة مؤشرات تنوع ألفا (A) لاحظت OTUs ، (B) مؤشر ACE ، (C) مؤشر تنوع Shannon ، و (D) مؤشر Simpson بين أربع مجموعات مختلفة. تظهر أمعاء نحل العسل المصابة بداء الطباشير فروقًا ذات دلالة إحصائية بين المجموعات.
التنوع البكتيري أعلى بشكل ملحوظ في أمعاء نحل العسل المصابة بحضنة الطباشير مقارنة بنحل العسل الآخر. تكون تركيبة نوزيما صحية وميكروبيوم نحل عسل ضعيف أقل بكثير من نحل العسل المصاب بحضنة الطباشير ، والذي لوحظ أيضًا في مؤشر تنوع شانون وسيمبسون. يوضح مخطط Venn المجتمع الميكروبي المشترك بين العينات (الشكل 6). يحتوي نحل العسل المصاب بالنوزيما على أقل عدد من وحدات OTU الفريدة والشاملة مقارنة بالمجموعات الأخرى. العوامل الممرضة 12 00734 g006 550 الشكل 6. مخطط Venn رباعي الاتجاهات يوضح عدد وحدات OTU الفريدة المشتركة عند مستوى القطع 0.03 بين عينات أمعاء نحل العسل. تحتوي عينات الطباشير على أعلى تنوع OTU وأكبر عدد من OTUs الفريدة.
أظهر نحل العسل المصاب بحضنة الطباشير أكثر وحدات OTU البكتيرية الفريدة مقارنة بنحل العسل النزيما الضعيف والمسيطر عليه. تظهر أمعاء نحل العسل الضابطة الوجود المهيمن للجيلياميلا ، واللاكتوباسيلوس ، والفريشيلا ، والسنودجراسيلا ، والآسايا ، بينما أظهر نحل العسل المصاب بالنوزيما وجود الجيلياميلا ، واللاكتوباسيلوس ، والفريشيلا ، والسنودجراسيلا ، والبكتيريا المعوية ، والعائلة الفرانكونية ، وأعضاء الفصيلة المعوية. (الشكل 1 والجدول التكميلي S2). أظهر نحل العسل الضعيف وجود أجناس Gilliamella و Lactobacillus و Frischella و Snodgrassella و Pantoea وأفراد عائلة Enterobacteriaceae. في غضون ذلك ، يُظهر نحل العسل المصاب بحضنة الطباشير وجود Lactobacillus و Pseudoflavonifractor و Alistipes و Oscillibacter و Paenibacillus وثلاثة أجناس بكتيرية غير معروفة باعتبارها الأجناس السائدة.
4 -
نتائج كان التركيز الأساسي للدراسة هو تحليل ومقارنة المجتمعات البكتيرية الموجودة في أمعاء نحل العسل المصابة بـ Ascosphaera apis ، ومقارنة هذه النتائج مع تلك الموجودة في نحل العسل المصاب بالنوزيما سيرانا والضعيف النشط. في حالة نحل العسل المصاب بالنوزيما ، تم العثور على مجموعة Proteobacteria مهيمنة بشكل كبير داخل المجتمع البكتيري ، وهي خاصية لوحظت أيضًا في نحل العسل ضعيف النشاط. ومع ذلك ، عند فحص نحل العسل المصاب بـ Ascosphaera (Chalkbrood) ، تباينت التركيبة البكتيرية إلى حد كبير ، حيث وجد أن هذا النحل يحتوي على كميات كبيرة من المواد الصلبة ، بدلاً من البكتيريا المتقلبة.
يوجد جنس Lactobacillus في الغالب في جميع المجموعات الأربع من أحشاء نحل العسل ، بغض النظر عن العدوى أو الضعف. توجد أجناس Gilliamella و Frischella و Snodgrassella في أحشاء نحل العسل الضعيفة والضعيفة والسيطرة ، ولكنها ليست موجودة بشكل كبير في نحل العسل المصاب بداء الطباشير. هذا يدل على أن هذه الأجناس الثلاثة تتأثر بشكل كبير بعدوى Ascosphaera apis في نحل العسل. أظهرت الدراسات أن نحل العسل المصاب بـ Nosema ceranae له تنوع جرثومي منخفض في الأمعاء وتغير في بنية المجتمع الميكروبي. على وجه التحديد ، وجد أن انتشار أصناف بكتيرية معينة ، مثل Lactobacillus و Bifidobacterium ، ينخفض في النحل المصاب. هذه البكتيريا مهمة للحفاظ على بيئة أمعاء صحية والمساعدة في الهضم. قد يؤدي انخفاض تنوع بكتيريا الأمعاء وتغير بنية المجتمع الميكروبي إلى هكتار خمس عواقب سلبية على صحة وبقاء نحل العسل. على سبيل المثال ، يمكن لبكتيريا الأمعاء المعطلة أن تجعل نحل العسل أكثر عرضة لمسببات الأمراض الأخرى والضغوط البيئية. تم العثور على جنس Lactobacillus باستمرار في أمعاء نحل العسل في جميع المجموعات الأربع ، بغض النظر عن حالة العدوى أو الضعف [49]. علاوة على ذلك ، لوحظت أجناس Gilliamella و Frischella و Snodgrassella في أحشاء نحل العسل المصاب بالنوزيما والضعيف والسيطرة ، ولكنها غير موجودة بشكل كبير في نحل العسل المصاب بداء الطباشير. تشير هذه النتيجة إلى أن هذه الأجناس الثلاثة قد تأثرت بشكل كبير بعدوى Ascosphaera apis في نحل العسل [49]. أظهر البحث أن نحل العسل المصاب بـ Nosema ceranae يُظهر تنوعًا منخفضًا في البكتيريا المعوية وتغيرًا في بنية المجتمع الميكروبي [2]. على وجه التحديد ، يتناقص انتشار بعض الأصناف البكتيرية ، مثل Lactobacillus و Bifidobacterium ، في النحل المصاب. هذه البكتيريا ضرورية للحفاظ على بيئة أمعاء صحية ودعم الهضم. قد يؤثر الانخفاض في تنوع بكتيريا الأمعاء وتغير بنية المجتمع الميكروبي سلبًا على صحة نحل العسل وبقائه على قيد الحياة. على سبيل المثال ، يمكن أن تزيد بكتيريا الأمعاء المعطلة من قابلية نحل العسل لمسببات الأمراض الأخرى والضغوط البيئية.
هناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم الأدوار المحددة لهذه البكتيريا في الأمعاء. تؤدي عدوى Ascosphaera apis في نحل العسل بشكل ساخر إلى تغيير بنية المجتمع البكتيري في القناة الهضمية ، والتي يمكن تأكيدها أيضًا من خلال تحليل التنوع بيتا (الشكلان التكميليان S1 و S2) باستخدام شجرة UPGMA النشوءية وتحليل PCoA. بشكل عام ، فإن تأثير عدوى Nosema ceranae و Ascosphaera apis على بكتيريا الأمعاء في نحل العسل يسلط الضوء على الطبيعة المعقدة والمترابطة للمجتمعات الميكروبية في صحة نحل العسل ويؤكد على أهمية دراسة هذه التفاعلات لفهم مجموعات نحل العسل وحمايتها بشكل أفضل.
* ORCID
المؤلفون 1 كلية الصيدلة ، جامعة Chungbuk الوطنية ، Chungbuk 28160 ،
جمهورية كوريا 2 قسم التكنولوجيا الحيوية والبيئية ، كلية العلوم الطبيعية ، جامعة سيول النسائية ، سيول 01797 ، جمهورية كوريا 3 قسم العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا 4 قسم تعليم الأحياء ، كلية التربية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا * المؤلفون الذين يجب توجيه المراسلات إليهم. † ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل. مسببات الأمراض 2023 ، 12 (5) ، 734 ؛ https://doi.org/10.3390/pathogens12050734 تم الاستلام: 30 آذار (مارس) 2023 / المنقح: 11 أيار (مايو) 2023 / مقبول: 12 أيار (مايو) 2023 / تاريخ ا المواد التكميلية يمكن تنزيل المعلومات الداعمة التالية على: https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12050734/s1. الجدول التكميلي S1: تكوين المجتمع البكتيري على مستوى الشعبة. يتم عرض الوفرة النسبية المئوية للأنواع البكتيرية على مستوى الشعبة للعينات. الوفرة النسبية <1٪ عبر جميع العينات موضحة على أنها "أخرى" ؛ الجدول التكميلي S2: تكوين المجتمع البكتيري على مستوى الجنس. يتم عرض الوفرة النسبية المئوية للأصناف البكتيرية على مستوى الجنس للعينات. الوفرة النسبية <1٪ عبر جميع العينات موضحة على أنها "أخرى" ؛ الجدول التكميلي S3: مؤشرات تنوع ألفا ؛ الشكل التكميلي S1: شجرة النشوء والتطور UPGMA بناءً على مسافة unifrac الموزونة عبر العينات. تم تجميع التسلسلات بالتساوي عبر عينات فردية (35000 تسلسل لكل عينة) قبل التحليل ؛ الشكل التكميلي S2: مخطط PCoA لتنوع بيتا في بكتيريا الأمعاء بناءً على مسافات Unifrac المرجحة لنحل العسل. تمثل كل نقطة بيانات عينة فردية. تم تجميع التسلسلات بالتساوي عبر عينات فردية (35000 تسلسل لكل عينة) قبل التحليل. الكاتب الاشتراكات * ORCID 1 كلية الصيدلة ، جامعة Chungbuk الوطنية ، Chungbuk 28160 ، جمهورية كوريا 2 قسم التكنولوجيا الحيوية والبيئية ، كلية العلوم الطبيعية ، جامعة سيول النسائية ، سيول 01797 ، جمهورية كوريا 3 قسم العلوم البيولوجية والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا 4 قسم تعليم الأحياء ، كلية التربية ، جامعة تشونغبوك الوطنية ، تشونغجو 28644 ، جمهورية كوريا *
المؤلفون الذين يجب توجيه المراسلات إليهم. †
ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل. مسببات الأمراض 2023 ، 12 (5) ، 734 ؛ https://doi.org/10.3390/pathogens12050734 تم الاستلام: 30 آذار (مارس) 2023 / المنقح: 11 أيار (مايو) 2023 / مقبول: 12 أيار (مايو) 2023 / تاريخ
ا
تعليقات