أول كشف عن فيروسات نحل العسل في الأردن بواسطة RT-PCR نزار حداد * , ؤآخرون. نبذة مختصرة
تعد وفيات نحل العسل مشكلة خطيرة يتعين على النحالين مواجهتها بشكل دوري في الأردن وفي جميع أنحاء العالم. ال قد يكون وجود فيروسات نحل العسل ، بالإضافة إلى مسببات الأمراض والطفيليات الأخرى أحد أسبابه المحتملة. في هذا العمل،
تم فحص عينات نحل فردية من منطقة عجلون في الأردن بحثاً عن ستة فيروسات لنحل العسل باستخدام RT-PCR ومحددة الاشعال. تم اكتشاف فيروس شلل النحل الحاد (ABPV) ، فيروس الحضنة (SBV) وفيروس الجناح المشوه (DWV) في العينات ، بينما فيروس خلية الملكة السوداء (BQCV) ، وفيروس شلل النحل المزمن (CBPV) وفيروس كشمير النحل (KBV) لم يتم الكشف عنها. هذا هو التقرير الأول للكشف عن فيروسات النحل في الأردن باستخدام التقنيات الجزيئية. الكلمات المفتاحية: فيروسات نحل العسل ، RT-PCR ، الواسمات الجزيئية.
المقدمة
تلعب صناعة تربية النحل دورًا رئيسيًا في الزراعة إنتاج في الأردن. قدرت دراسة حديثة أن ، في الأردن ، إجمالي قيمة إنتاجية 12 محصولاً مُلقَّحاً بالنحل كان 117.4 مليون دولار في 2005 ، منها 50.7 مليون دولار يمكن أن تكون مباشرة المنسوب إلى التلقيح بواسطة نحل العسل (حداد وآخرون ، 2007) ، والتي تزيد عن 16 ضعف قيمة المنتج المحلي العسل (3.1 مليون دولار). في الآونة الأخيرة ، نسبة كبيرة من النحالين اشتكوا من نفوق النحل في خلاياهم ، خاصة في محافظة عجلون. الوفيات الجماعية لنحل العسل (Apis mellifera) هي واحدة من أخطر المشاكل التي يواجه مربي النحل والصناعات التابعة في جميع أنحاء العالم. أ المثال البياني هو الإعلان الاقتصادي والاجتماعي على نطاق واسع والاضطرابات السياسية التي سببتها المستعمرة الواسعة الانهيار بين مربي النحل المهاجرين في الولايات المتحدة الأمريكية (Cox Foster et al.، 2007؛ Stokstad، 2007a؛ 2007b) وما شابه انهيارات المستعمرة وتعطل الزراعة خلال القرن الماضي (Beuhne، 1910؛ Wilson and Menapace، 1979 ؛ أورتل ، 1965 ؛ فوت ، 1966 ؛ ريني ، 1921 ؛ بيلي ، 1964 ؛ Goodacre ، 1943). هناك العديد من العوامل التي قد تساهم في تكون النحل بما في ذلك طفيليات النحل والأمراض (Ball and بيلي ، 1997 ؛ كوكس فوستر وآخرون ، 2007) ، آثار العوامل المسببة المستخدمة لعلاج مثل هذه الأمراض والعوامل المناخية (بيلي وآخرون ، 2001 ؛ ويلسون وميناباس ، 1979) و التعرض للمبيدات الحشرية أو المبيدات المستخدمة في الزراعة (Antunez et al.، 2006؛ Suchail et al.، 2004). إن ارتباط الفيروسات بنفوق نحل العسل هو أ سبب خاص للقلق في جميع أنحاء العالم (بيلي وآخرون ، 1981 ؛ 1983 ؛ هورنيتسكي ، 1987 ؛ ألين آند بول ، 1996 ؛ نوردستروم وآخرون آل ، 1999 ؛ Tentcheva وآخرون ، 2004 أ ، ب ؛ تود وآخرون ، 2007). ال يستضيف نحل العسل ما لا يقل عن 18 فيروسًا (بيلي آند بول ، 1991). كلها عادة بدون أعراض وتستمر في * وحدة أبحاث النحل ووحدة التكنولوجيا الحيوية بالمركز القومى للبحوث الزراعية ونقل التكنولوجيا (NCARTT) ، إلى Baq 19381 ، الأردن. ** قسم علوم الأحياء جرش الخاص الجامعة ، جرش ، الأردن. *** قسم العلوم البيولوجية ، جامعة كوينز ، بلفاست ، BT9 7BL ، بلفاست ، أيرلندا الشمالية. drnizarh@yahoo.com تم استلامه بتاريخ 21/11/2007 وتم قبوله للنشر بتاريخ 29/5/2008. © 2008 دار النشر / الجامعة الأردنية. كل الحقوق محفوظة. الكشف الأول عن… نزار حداد وآخرون. -243- الخلايا كعدوى خفية (Bailey and Ball ، 1991 ؛ Ball and بيلي ، 1997). بعضها مثل فيروس شلل النحل المزمن (CBPV) ، فيروس خلية الملكة السوداء (BQCV) ، فيروس الحضنة (SBV) ، فيروس الجناح المشوه (DWV) والجناح الغائم الفيروس (CWV) ، سينتج أيضًا سريريًا يمكن التعرف عليه الأعراض في مراحل معينة من الحياة (بيلي وبول ، 1991 ؛ ألين والكرة ، 1996). متواليات النوكليوتيدات متاحة الآن ل العديد من النحل ، مما يتيح تطوير الأحماض النووية المقايسات التشخيصية القائمة على أساس (على سبيل المثال ، Tentcheva وآخرون ، 2004b ؛ Chen وآخرون ، 2005 ؛ توبلي وآخرون ، 2005 ؛ Chantawannakul وآخرون ، 2006 ؛ Berenyi وآخرون ، 2006 ؛ Grabesteiner et al.، 2007). في هذه الدراسة نستخدم العديد من هذه الاختبارات لتقييم وجود فيروسات نحل العسل في بعض مناحل محافظة عجلون. المواد والأساليب جمع العينات تم جمع عينات نحل عاملة بالغة من 13 عينة انهارت الخلايا التي نشأت من 7 خلايا متفرقة على نطاق واسع مناحل محافظة عجلون. تم جمع العينات بشكل عشوائي من داخل الخلايا ، يتم نقلها على الجليد و نقل إلى -25 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخراج الحمض النووي الريبي تم تجانس النحل الفردي باستخدام المدقة و هاون مع 1 مل من كاشف Trizol (Biobasic) وتحويلها إلى 1.5 مل من الأنابيب الدقيقة. تم فصل جزء البروتين في المرحلة العضوية (السفلى) باستخدام الكلوروفورم وتم ترسيب الحمض النووي الريبي من الطور المائي (العلوي) بـ 1 مل من الأيزو بروبانول والطرد المركزي (14000 دورة في الدقيقة). ال تم غسل حبيبات الحمض النووي الناتجة مرتين بنسبة 70٪ الإيثانول والمعلق في الماء الخالي من نوكلياز. تضخيم RT-PCR تم تحليل كل عينة من RNA لوجود نحلة تسلسل الفيروسات باستخدام نظام Access RT-PCR (ص روما الولايات المتحدة) وفقًا لبروتوكول الشركة. التضخيم حدث في خليط تفاعل 25 ميكرولتر يحتوي على تفاعل 1x المخزن المؤقت ، 0.2mM dNTP ، 1 ميكرومتر لكل من البادئين لكل منهما الفيروس ، 2 ملي MgSO4 ، 0.1 وحدة من فيروس داء الأرومة النقوية الطيرية إنزيم النسخ العكسي ، 0.1 وحدة من بوليميريز الحمض النووي Tfl و 250 إلى 500 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي. التسلسلات الأولية والمتوقعة يتم عرض طول منتجات RT-PCR في الجدول 1. النسخ العكسي عند 48 درجة مئوية لمدة 48 دقيقة. تلاه 40 دورات 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. و 68 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وتمديد نهائي عند 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. الضوابط السلبية تم تضمينها في كل تجربة RT-PCR. عشرة ميكرولتر من المنتج المتضخم بالكهرباء في 2٪ [اغروس) جل وملطخ ببروميد إيثيديوم. كانت العصابات تصويرها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. كانت أحجام الشظايا تم تحديده بالرجوع إلى سلم 100-BP (Promega). نتائج ومناقشة محافظة عجلون هي ثاني أهم منطقة في الأردن لتربية النحل من حيث عدد النحالين والخلايا المدارة. جمع النحل العامل البالغ من ثلاثة عشر مستعمرة في سبعة مناحل منتشرة على نطاق واسع من ومحافظة عجلون تم فحص لوجود ستة فيروسات نحل العسل (ABPV و BQCV و CBPV و DWV و KBV و SBV) باستخدام RT-PCR. النتائج موضحة في الشكل 1. خارج من الخلايا الـ 13 التي تم فحصها ، 92٪ مصابة بـ DWV ، 8٪ مع SBV و 16٪ مع ABPV. لم يصب أي منهم باستخدام CBPV أو BQCV أو KBV. أصيبت عدة خلايا بأكثر من فيروس. يشير هذا إلى أن DWV هو ملف الفيروس الأكثر شيوعاً في طوائف النحل المنهارة في الأردن. هذه البيانات مماثلة للدراسات الاستقصائية القابلة للمقارنة التي أجريت في مكان آخر (Tentcheva وآخرون ، 2004 أ). تقريبا كل العينات من الخلايا التي ظهرت فيها وفيات النحل مصابة بفيروس واحد على الأقل أو مصاب بأكثر من فيروس واحد. هذه هي الحالة الأولى لفيروس النحل القائم على الحمض النووي كشف في الاردن. لاحظ روبنسون (1981) سابقًاأعراض فيروس الحضانة في الأردن والعديد من فيروسات النحل تم اكتشافها سابقًا مصليًا في مناطق أخرى دول شبه الجزيرة العربية (Allen and Ball ، 199ا). تم اكتشاف DWV بواسطة RT-PCR في الإمارات العربية المتحدة طيران الإمارات (Berenyi et al. ، 2007) على الرغم من عدم وجود فيروسات أخرى تم مسحها في هذه الدراسات. تظهر هذه النتائج الأولية وجود عدة فيروسات النحل ، ولا سيما DWV ، في النحل الأردني المحتضر الخلايا هذا مشابه للمسوحات التي أجريت في بلدان أخرى البلدان (Nordström et al.، 1999؛ Antunez et al.، 2006؛ Tentcheva وآخرون ، 2004 ب ؛ Berenyi وآخرون ، 2006 ؛ تود وآخرون 2007 ؛ كوكس فوستر وآخرون ، 2007). هناك حاجة إلى مزيد من البحث تحديد العوامل الأخرى التي هي أيضًا تفاضلية المرتبطة بوفيات الطوائف ، مثل الإصابة بـ العث الطفيلي (الفاروا المدمر ، Acarapis woodi) ، نوزيما apis و N. cerana (PSU ، 2007) ، والأمراض البكتيرية وأي الآثار المحتملة للمعالجة الكيميائية للخلايا أو العلف مصادر. هذه النتائج مهمة أيضًا لزيادة توعية النحالين والباحثين عن النحل والصناعات الزراعية المعتمدة على النحل في الأردن والعرب عالم من الأمراض والطفيليات التي تهدد النحل الصناعة في جميع أنحاء العالم موجودة بالمثل في البلدان العربية وترتبط بالمثل مع معدل وفيات مستعمرة النحل. شكل (1): الكشف عن الفيروسات المختلفة في خلايا النحل المصابة الأردنية. تم إجراء RT-PCR باستخدام بادئات تفاضلية تضخيم التسلسلات الخاصة بالفيروس. اللوحة أ: فيروس الجناح المشوه (DWV) ، اللوحة ب: فيروس الحضنة (SBV) ، اللوحة ج: فيروس شلل النحل الحاد (ABPV). الممرات 1-13: عينات مختلفة من النحل. المسار 14: التحكم السلبي ، RT-PCR بدون أ قالب. المسار M: علامة حجم الحمض النووي. الكشف الأول عن… نزار حداد وآخرون. -245- شكر وتقدير تود مجموعة البحث أن تشكر Vita Europe والمركز الوطني للزراعة البحث والإرشاد للحصول على الدعم المالي و أحمد بطاينة من وحدة أبحاث النحل للمساعدة مع جمع العينات. المسؤوليات عن هذا العمل كانت على النحو التالي: NH - التخطيط والتمويل والتجريبي التصميم والتنفيذ والتحليل والكتابة. MB - تحليل ، جاري الكتابة؛ جلالة- تحليل. JRdM التخطيط والتحليل ، جاري الكتابة المجلة الأردنية للعلوم الزراعية ، المجلد 4 ، العدد 3 ، 2008 -242-
تعليقات